SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE OZONÍDEOS A PARTIR DE ÓLEOS VEGETAIS

Serviço Público Federal / Ministério da Educação
Fundação Universidade Federal de Mato Grosso do Sul
Centro de Ciências Exatas e Tecnologia
Programa de Pós-graduação – Mestrado em Química
Nathália Rodrigues de Almeida
Orientador: Prof. Dr.Adilson Beatriz
Co-orientador: Eduardo José de Arruda (UFGD)
Campo Grande – 2013

INTRODUÇÃO

Os ácidos graxos são moléculas encontradas naturalmente na forma esterificada com o glicerol. Estas moléculas são os principais constituintes dos óleos e gorduras. A exploração industrial dos óleos e gorduras, tanto para os alimentos e produtos oleoquímicos, baseia-se na modificação química dos grupos carbonila (C=O) e das cadeias insaturadas (C=C) presentes nos ácidos graxos (Figura 1). A cadeia alquílica do ácido graxo é susceptível a oxidação nas ligações duplas carbono-carbono. A oxidação dessas ligações é utilizada para clivar cadeias alquílicas ou para introduzir funcionalidade adicional ao longo da cadeia (SHARIDI, 2005).



Figura 1: Sítios para modificação química na molécula de triaciglicerol - grupos
carbonila (C=O) e das cadeias insaturadas (C=C).

Um importante exemplo que tem sido descrito na literatura envolve oxidação de ligações duplas utilizando reações de ozonólise, um método muito efetivo, no qual o ozônio reage completamente com o material de partida (PRYDE, 1960).
Os produtos da reação de ozonólise podem ou não conter oxigênio ativo, ou seja, grupos funcionais peroxídicos no qual são capazes de oxidar o íon iodeto a iodo (BAILEY, 1978). O ozônio reage com as ligações duplas dos ácidos graxos presentes nos óleos vegetais, formando ozonídeos e compostos peroxídicos responsáveis pela atividade antimicrobiana e propriedades estimulantes de regeneração e reparo do tecido (ZANARDI et al., 2008).

As propriedades antimicrobianas de derivados do ozônio como os óleos vegetais ozonizados representam grande interesse farmacêutico para o tratamento de patologias dermatológicas, como infecções de pele, úlceras, feridas crônicas, entre outras (VALACCHI et al., 2005).

A pele é o maior órgão do corpo, indispensável para a vida humana e fundamental para o perfeito funcionamento fisiológico do organismo. Como qualquer outro órgão, fatores patológicos podem causar o desenvolvimento de alterações na sua constituição como, por exemplo, as úlceras de pele, podendo levar à sua incapacidade funcional (MORAIS et al., 2008).

1.1. Feridas crônicas e úlceras de pele

Acredita-se que cerca de 3% da população brasileira é portadora de feridas crônicas nos membros inferiores e que aproximadamente 4 milhões de pessoas sejam portadoras de lesões crônicas ou tenham algum tipo de complicação no processo de cicatrização (OLIVEIRA, 2007; MANDELBAUM et al, 2003 b). No Brasil, as feridas acometem grande parte da população, constituindo assim, um sério problema de saúde pública. Embora sejam escassos os registros de atendimentos a pacientes portadores de feridas, o elevado número de portadores contribui para onerar o gasto público, além de interferir na qualidade de vida da população (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002).

As feridas comprometem a qualidade de vida de seus portadores podendo ocasionar dor, inclusive severa e contínua, odor, dificuldade ou incapacidade de locomoção, baixa autoestima, nervosismo, medo, depressão, isolamento social, dependência física, alteração da autoimagem, entre outras (OLIVEIRA, 2007).

De acordo com a sua duração, podem ser classificadas em crônicas, agudas e pós-operatórias. As feridas crônicas são de longa duração ou de decorrência frequente, como úlceras por pressão e úlceras venosas e arteriais.
As feridas agudas são as do tipo traumáticas, como cortes, abrasões, queimaduras, entre outras. Essas lesões geralmente respondem rápido ao tratamento e cicatrizam sem complicações. As feridas pós-operatórias são causadas intencionalmente, podendo cicatrizar por primeira intenção, caso as bordas sejam mantidas próximas, ou por segunda intenção caso necessitem, por exemplo, de drenagem de material (OLIVEIRA, 2007).

As feridas podem ter diversas causas, como trauma (mecânico, físico e químico), intencional (cirurgias), isquemia (úlcera arterial de membros inferiores) e pressão (úlceras de decúbito) (MANDELBAUM et al., 2003 a).

Entre os diversos tipos de lesões, as mais freqüentemente encontradas nos serviços da rede básica de saúde são as úlceras venosas, as arteriais, as hipertensivas, as de pressão e as neurotróficas, comuns em algumas patologias que acometem o sistema nervoso periférico, como a hanseníase, o alcoolismo e o diabetes Mellitus (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002).

Cerca de 6% das internações hospitalares relacionadas aos diabéticos são em consequência de úlceras nos membros inferiores. A úlcera é uma das complicações mais devastadoras do Diabetes Mellitus, sendo responsável por 50 a 70% das amputações não traumáticas, além de concorrer por 50% das internações hospitalares (TOSCANO & MENGUE, 2004).

Os custos dos tratamentos de patologias relacionadas à deficiência no processo de cicatrização aumentam a importância dos estudos em busca de medicamentos e curativos capazes de interagir com o tecido lesado, tendo por objetivo acelerar o processo de cicatrização (MENDONCA & COUTINHONETTO, 2009).

A cicatrização de feridas é um processo complexo que envolve a organização de células, sinais químicos e matriz extracelular com o objetivo de reparar o tecido lesado (MENDONCA & COUTINHO-NETTO, 2009). Diferentes classificações didáticas são utilizadas para facilitar o entendimento do processo. Alguns autores discorrem sobre cinco fases: coagulação, inflamação, reconstrução ou proliferação, epitelização e maturação ou remodelação
(MANDELBAUM et al., 2003 a).

A fase de coagulação inicia imediatamente após o surgimento da ferida, depende da atividade plaquetária e da cascata de coagulação. Ocorre uma complexa liberação de substâncias vasoativas, proteínas adesivas, fatores decrescimento e proteases (MANDELBAUM et al., 2003a).

Intimamente ligada à fase anterior, a fase inflamatória depende, além de inúmeros mediadores químicos, das células inflamatórias, como os leucócitos polimorfonucleares (PMN) responsáveis pela fagocitose das bactérias e os macrófagos (MANDELBAUM et al., 2003 a). O macrófago é a principal célula do processo de reparo tecidual, responsável pela degradação e remoção de componentes do tecido conjuntivo danificado, como colágeno, elastina e proteoglicanas (MENDONCA & COUTINHO-NETTO, 2009). Além dessas funções, as células inflamatórias produzem fatores de crescimento, que preparam a ferida para a fase proliferativa, fase em que os fibroblastos e células endoteliais também serão recrutados (SINGER & CLARK, 1999).

Dividida em três subfases, a proliferação é responsável pelo "fechamento" da lesão propriamente dita. A primeira das subfases da proliferação é a re-epitelização, onde ocorre a movimentação das células epiteliais oriundas tanto da margem como de apêndices epidérmicos localizados no centro da lesão; os fibroblastos produzem a nova matriz extracelular necessária ao crescimento celular enquanto os novos vasos sanguíneos carreiam oxigênio e nutrientes necessários ao metabolismo celular local (MENDONCA & COUTINHO-NETTO, 2009; SINGER & CLARK, 1999).

Segundo Hinman & Maibach (1963) as feridas superficiais abertas e ressecadas re-epitelizam mais lentamente do que as ocluídas e, portanto, aumentam ou dificultam o processo de cicatrização.

A segunda fase da proliferação inclui a fibroplasia e formação da matriz, que é extremamente importante na formação do tecido de granulação (elementos celulares, incluindo fibroblastos, células inflamatórias e componentes neovasculares e da matriz, como a fibronectina, as glicosaminoglicanos e o colágeno). A formação do tecido de granulação depende do fibroblasto, célula produtora de colágeno, elastina, fibronectina, glicosaminoglicanos e proteases, estas responsáveis pelo desbridamento e remodelamento fisiológico (MANDELBAUM et al., 2003a).

A última fase da proliferação é a angiogênese, etapa fundamental do processo de cicatrização, na qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de vasos pré-existentes. Os novos vasos participam da formação do tecido de granulação provisório e supre de nutrientes e de oxigênio o tecido em crescimento (FOLKMAN & SHING, 1992; MENDONCA & COUTINHO-NETTO, 2009).

A epitelização constitui a etapa que levará ao fechamento superficial da ferida, por meio da multiplicação das células epiteliais da borda (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002).

A última das fases da cicatrização, a remodelação, dura meses e é responsável pelo aumento da força de tensão e pela diminuição do tamanho da cicatriz e do eritema (MANDELBAUM et al., 2003 a). Nessa fase do processo de cicatrização o corre uma tentativa de recuperação da estrutura tecidual normal. Essa fase é marcada por maturação dos elementos e alterações na matriz extracelular, ocorrendo o deposito de proteoglicanas e colágeno (MENDONCA & COUTINHO-NETTO, 2009).

O surgimento de infecção é um dos principais fatores que influenciam o processo de cicatrização. A infecção prolonga o estágio inflamatório da cicatrização, pois as células precisam combater grande número de bactérias, além de inibir também a capacidade dos fibroblastos de produzir colágeno (MANDELBAUM et al., 2003a).


1.2. Os ácidos graxos e os óleos vegetais

Os ácidos graxos podem ocorrer na natureza como substâncias livres ou esterificadas. A maior parte dos ácidos graxos naturais encontra-se esterificada no glicerol formando os triacligliceróis (TGs), componentes dos óleos e gorduras. Os óleos são misturas relativamente complexas de TGs e, são os lipídios mais amplamente distribuídos na natureza (VIANNI & BRAZFILHO, 1996).

Os óleos são insolúveis em água, solúveis em solventes orgânicos e líquidos à temperatura ambiente (20 ºC), enquanto as gorduras são sólidas a mesma temperatura (GIOIELLE, 1996). Essa diferença entre óleos (líquidos) e gorduras (sólidas), à temperatura ambiente, reside na proporção de grupos acila saturados e insaturados presentes nas cadeias graxas dos TGs (SHARIDI, 2005).

Com raras exceções, os ácidos graxos são ácidos monocarboxílicos de cadeia alifática com número par de átomos de carbono. A maioria possui cadeias de 4 a 22 carbonos, sendo a cadeia de 18 carbonos a mais comum. Os que ocorrem naturalmente partilham uma biossíntese em comum, onde a cadeia é construída a partir de unidade de acetato (2 átomos de carbono) e as ligações duplas cis são inseridas pela enzima dessaturase em posições específicas em relação ao grupo carbonila (SHARIDI, 2005).

Os ácidos graxos representam cerca de 95% da massa molecular dos TGs. As propriedades físicas, químicas e nutricionais dos óleos dependem da natureza, do número de átomos de carbono e posição dos grupos acila saturados e insaturados presentes na molécula do TGs (VIANNI & BRAZFILHO, 1996).

Nos ácidos graxos saturados, os átomos de carbono estão ligados entre si por ligações simples (ligações _) e nos ácidos graxos insaturados por ligações simples e duplas (ligações _). Na maioria dos ácidos graxos insaturados, as ligações duplas estão localizadas na cadeia de forma não conjugada (sistema 1,4 diênico), frequentemente separadas por um grupo metileno (_-CH2), apresentando configuração espacial do tipo cis = Z (VIANNI
& BRAZ-FILHO, 1996).

A configuração cis pode ser convertida no isômero trans durante o processo de rancidez oxidativa e nas reações de hidrogenação catalítica na presença de níquel ou outro metal catalítico, geralmente empregada em processos de hidrogenação parcial. O aquecimento prolongado de óleos vegetais em temperaturas elevadas também induz a formação de isômeros dos ácidos graxos polinsaturados (VIANNI & BRAZ-FILHO, 1995; MOREIRA et al.2002).
No sistema de nomenclatura oficial da IUPAC, o número de átomos de carbono é indicado por um prefixo grego. Os ácidos láurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquídico e behênico, possuem 12, 14, 16, 18, 20 e 22 átomos de carbonos, respectivamente e são designados pelos prefixos dodeca-, tetradeca-, hexadeca-, octadeca-, eicosa- e docosa-. Os ácidos graxos saturados têm sufixo anóico, e os insaturados tem sufixo enóico. A posição da ligação dupla na cadeia carbônica é definida por número arábico, atribuindo-se 1 ao carbono da carbonila. O ácido linoléico, é denominado oficialmente por ácido 9 (Z),12 (Z) -octadecadienóico (VIANNI & BRAZ-FILHO, 1996). A tabela 1 apresenta a fórmula molecular e a nomenclatura de alguns ácidos graxos saturados e insaturados.

Tabela 1: Fórmula molecular e nomenclatura de alguns ácidos graxos.



A estrutura de um ácido graxo pode também ser indicada mediante uma notação simplificada, na qual se escreve o número de átomos de carbono seguido de dois pontos e depois um número que indica quantas ligações duplas estão presentes na molécula. O linoléico, nesse caso, seria representado por 18:2 ou C18:2 (SHARIDI, 2005; VIANNI e BRAZ-FILHO, 1996). 

A posição das ligações duplas pode ser indicada de várias formas: definindo a posição e a configuração, ou localizando as posições das ligações duplas relativas aos grupos metila e carbonila nas extremidades da cadeia. A posição da ligação dupla relativa ao grupo metila terminal pode ser representada por n-x ou _-x, onde x é o número de átomos de carbono a partir do grupo metila. A posição da primeira ligação dupla a partir do grupo carbonila é designada _x (SHARIDI, 2005).

Os ácidos graxos mais abundantes na natureza possuem 16 ou 18 átomos de carbono, estão entre eles os ácidos palmítico, esteárico, linoléico e oléico. O ácido oléico constitui em alguns casos mais da metade da composição total de muitos óleos e gorduras (VIANNI e BRAZ-FILHO, 1996). A tabela 2 apresenta a composição em ácidos graxos de diferentes óleos vegetais.

Tabela 2: Composição (%) de ácidos graxos em diferentes óleos vegetais.



Girassol (Helianthus annuus L.), uma das espécies de sementes oleaginosas mais antigas na América do Norte, pertence à família Asteraceae e ao gênero Helianthus. O óleo de girassol é caracterizado pela alta concentração de ácido linoléico (48-74%), seguida por ácido oléico (14-39%), sendo que a concentração de ácido linolênico é sempre baixa, em torno de 0,3
%. De acordo com o esperado para óleos com alta concentração de ácido
linoléico, o principal triacilglicerol é a trilinoleina (36,3%), seguida pela
dilinoleína (29,1%) e a trioleína praticamente inexistente (0,6%) (GUNSTONE,1994).

De origem asiática, a linhaça (Linum usitatissimum L.), que pertence à família das Lináceas, é uma das herbáceas mais antigas da história da humanidade. Das sementes é extraído o óleo, que é muito utilizado nas indústrias alimentícias, de tinta e vernizes, além da indústria cosmética. Esse óleo constitui uma das maiores fontes de ácido linolênico (18:3) (35 – 60%) e linoléico (18:2) (14 - 29%) (GUNSTONE, 1994).

O óleo de linhaça possui uma baixa estabilidade oxidativa, tornando impropria sua utilização como óleo comestível. No entanto a semente de linhaça é utilizada para melhorar o valor nutricional dos alimentos como fonte de ácido linolênico (ômega 3). Os ácidos linolênico e linoléico são precursores dos demais ácidos graxos da família ômega 3 (_-3) e ômega 6 (_ -6), respectivamente, e conhecidos como essências, pelo fato do organismo humano não sintetiza-los, tornando-os indispensáveis, principalmente, pela ingestão de alimentos que os contém. O óleo possui coloração amarelodourado, marrom ou âmbar, e deve ser prensado a frio, pois a temperatura é uma variável determinante para acelerar o processo de oxidação (LOPES, 2009).

O baru (Dipteryx alata Vog.) é uma árvore do cerrado brasileiro pertencente à família Leguminosae. Sua distribuição é ampla no Brasil, abrangendo os estados de Góias, Minas Gerais, São Paulo, Tocantins, Mato Grosso do Sul e Mato Grosso estendendo-se até a costa atlântica do Maranhão (SANO et al, 2004) Esta espécie produz frutos que contém uma amêndoa com sabor semelhante ao amendoim. O óleo extraído desta amêndoa possui em sua composição 50,4% de ácido oléico e 28,9% de ácido linoléico, sendo assim, importante matéria-prima para as indústrias farmacêuticas e oleoquímicas (TAKEMOTO, 2001).

Os ácidos graxos apresentam três funções principais: são componentes estruturais das membranas biológicas; atuam como precursores de mensageiros intracelulares e são oxidados gerando energia, na forma de adenosina trifosfato (ATP). Existem diversos tipos de ácidos graxos, mas se tratando de tratamento de feridas, o ácido linoléico e o ácido linolênico são os mais importantes, pois não são sintetizados pelos mamíferos, sendo assim chamados de ácidos graxos essenciais (AGE) (FERREIRA et al., 2012).

Os ácidos graxos essenciais, o linoléico (_-6 ou n-6) e linolênico (_3ou n-3) são de extrema importância as para funções celulares normais, e atuam como precursores para a síntese de ácidos graxos polinsaturados de cadeia longa como os ácidos araquidônicos (AA), eicosapentaenóico (EPA) e docosa-hexaenóico (DHA), que fazem parte de numerosas funções celulares como a manutenção da integridade e fluidez das membranas, atividade das enzimas de membrana e síntese de eicosanóides como as prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos (MOREIRA et al, 2002). Essas moléculas são importantes no processo de cicatrização de feridas, eles possuem capacidade de modificar reações inflamatórias e imunológicas, alterando funções leucocitárias e acelerando o processo de granulação tecidual (MANHEZI et al.2008).

O ácido linoléico exerce um importante papel quimiotáxico para macrófagos, sendo fundamental na expressão de componentes do sistema fibrinolítico (regulação da produção de colagenase); favorece o desbridamento autolítico no leito da ferida por contribuir com a produção de metaloproteínas, induzindo a granulação e podendo acelerar o processo de cicatrização.
Estudos demonstram que o ácido linoléico é capaz de inibir o crescimento de Staphylococcus aureus, alterando as sínteses de proteínas, parede celular, ácidos nucléicos e membranas celulares durante a divisão (GREENWAY & DIKE, 1979; MANDELBAUM et al., 2003 b).

O ácido linolênico é importante no transporte de gorduras, favorece a manutenção da integridade da barreira de permeabilidade epidérmica e acelera os processos cicatriciais. Age como importante agente restaurador tecidual por promover quimiotaxia e angiogênese, pela manutenção do meio úmido e aceleração do processo de granulação tecidual, ainda, protege a pele contra infecções por Staphylococcus aureus e proporciona a nutrição celular local MANDELBAUM et al., 2003 b; FERREIRA et al., 2012)

1.3. Ozônio

O ozônio é uma molécula simétrica, possui um átomo de oxigênio na posição central com carga parcial positiva e dois átomos de oxigênio terminais com cargas parciais negativas (CLAYDEN, 2007). A Figura 2 apresenta as estruturas de ressonância da molécula do ozônio.




O ozônio é cerca de cinquenta por cento mais denso que o oxigênio, apresenta-se como um gás incolor e de odor pungente, tem massa molecular igual a 48 u.m.a, liquefaz-se a -112°C e possui ponto de congelamento de 251,4°C (CHIATONNE et al., 2008).  O ozônio possui um alto poder de oxidação, (E0=2,08 V) quando comparado a outros agentes oxidantes como, por exemplo, H2O2 (E0= 1,78V), permitindo que a molécula possa reagir com uma numerosa classe de compostos (KUNZ et al., 2002).

A molécula do ozônio age como um dipolo, com propriedades eletrofílica e nucleofilica. O ozônio pode reagir com compostos orgânicos via oxidação direta ou com compostos inorgânicos em solução aquosa, onde o ozônio se decompõe em água a radical hidroxila (KUNZ et al., 2002; KHADRE et al., 2001).  As reações via oxidação direta com ozônio molecular são seletivas reagindo  apenas  com  compostos  alifáticos  insaturados  e  anéis aromáticos (KHADRE & YOUSEF, 2001).

Sua armazenagem é impedida pela sua baixa estabilidade, tornando necessária sua geração in situ. Através de descargas elétricas o oxigênio é dissociado, sendo a formação do ozônio (Figura 3) consequência da recombinação de espécies radicalares de oxigênio com moléculas de oxigênio presentes no sistema (KUNZ et al., 1998).




Desde a sua descoberta, esse gás despertou grande interesse, sendo atualmente empregado para as mais diversas finalidades. O ozônio (O3) é um poderoso agente antimicrobiano, com grande potencial de aplicação na indústria, principalmente alimentícia.  A altareatividade, penetrabilidade, decomposição espontânea em produtos o xicos, como o oxigênio molecular (O2), por exemplo, faz do ozônio um desinfetante viável (KIM et al.2009) . O ozônio está sendo utilizado no tratamento de água residual para reuso, no tratamento de efluentes, como agente branqueador de compostos orgânicos, na de sodorização de ambientes, em lavanderias hospitalares reduzindo os custos em energia para esterilização, na odontologia e na medicina, sendo sua prática conhecida como Ozonioterapia (CHIATONNE et al., 2008; BOCCI et al., 2009).

A Ozonioterapia é uma cnica médica, reconhecida em vários países do mundo (Alemanha, Itália, França, Portugal, Espanha, Cuba, Estados Unidos, Rússia, China e Japão) que utiliza o ozônio diluído em corrente de oxigênio puro (O3/O2) como agente terapêutico em grande mero de patologias. É considerada uma terapia natural, com poucas contra indicações e de efeitos secundários mínimos, se for corretamente realizada (BOCCI, 2005).
O médico alemão Christian Friedrich Schönbein, durante a PrimeirGuerra Mundial, difundiu o ozônio no tratamento de feridas em soldados alemães, obtendo excelentes resultados no controle de infeões, gangrenas e cicatrizações de feridas infectadas por Clostridium (BOCCI et al., 2009).

O efeito antimicrobiano do ozônio tem sido estudado com uma ampla variedade de microorganismos, como bactérias gram-positivas e negativas, esporos e células vegetativas (FETNER& INGOLS, 1956; GUZEL-SEYDIM et al., 2004; CHIATONNE et al., 2008).  Sendo mais efetivo contra células vegetativas de bacrias do que em esporos ou fungos. Entre as bacrias, as gram negativas são mais sensíveis ao ozônio do que as gram positivas (KHADRI et al, 2001). A parede celular das bacrias gram positivas é constituída por muitas camadas de peptideoglicana, formando uma estrutura espessa e rígida, em contraste, as paredes celulares de gram negativas contêm somente uma camada fina de peptideoglicana (TORTORA et al, 2005). Segund Pere e al, 1995,  N-acetil   glucosamina, present na peptideoglicana, foi resistente à ação do ozônio, em solução aquosa a pH 3 a 7. O que pode explicar, pelo menos em parte, a maior resistência de bactérias gram-positivas em relação às gram-negativas.

O mecanismo de ação do ozônio para inativação das bactérias é um processo complexo, pois o ozônio oxida vários constituintes celulares como proteínas, lipídios insaturados e enzimas da membrana celular; peptoglicanos da parede celular, enzima e ácidos nucléicos do citoplasma; além de proteínas e peptoglicanos da capa dos esporos bacterianos e capsídeos virais (KHADRE
& YOUSEF, 2001).

O que diferencia o ozônio de outros agentes biocidas é seu mecanismo de destruão dos microorganismos (Figura 4). Especificamente, o cloro, atua por difusão através da parede celular, agindo sobre os elementos vitais localizados no interior da célula, como enzimas, proteínas, DNA e RNA. O ozônio, por sua vez, age diretamente na parede da célula, causando sua ruptura e morte em menor tempo de contato, inviabilizando a recuperação dos microrganismos as oxidação (SNATURAL TECNOLOGIAS AMBIENTAIS LTDA, 2011).



Figura 4: Mecanismo de ação do ozônio em bacrias. 1- Bactéria; 2- Parede celular da bacria sendo atacada pelo Ozônio; 3- Oxidação da parede celular;
4, 5 e 6- Ruptura e destruão da bacria.

O gás ozônio pode afetar o sistema respiratório e causar sintomas de toxidade, como dor de cabeça, tontura, sensação de queimação na região dos olhos, irritação da garganta e tosse. No entanto, o ozônio é toxico para o sistema pulmonar durante inalação prolongada na concentração de 0.000µg/mL (0.2 ppm)  (BOCCI  et  al.,  2009;  GUZEL-SEYDIM  et  al.,  2004).Um indiduo pode detectar o cheiro característico do ozônio em concentraçõe0,01 a 0,05ppm (CHIATONNE et al., 2008).


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